Untargeted metabolomics

Author

FJC

Published

August 23, 2024

1 提取

1.1 组织（极性代谢物提取方案）

  1. 向20 mg组织中加入200 μL H2O，并冰上均匀化组织

  2. 添加入2 μL的IS溶液（母液浓度均为10 μg/mL的L-Phenyl-d82 μL），涡旋10 s

  3. 添加800 μL MeOH:ACN（v:v, 1:1），涡旋30 s，在冰水浴中超声10 mins

  4. 在-20 ℃下静置1 h，以促进蛋白质沉淀

  5. 在4 ℃，13000 rpm离心15 mins

  6. 取上清液，用真空浓缩器/氮吹仪在4 ℃下蒸发至干

  7. 干燥样品在-80 ℃下长期储存

  8. 在LC-MS分析前，使用100 μL ACN:H2O（v:v, 1:1）重悬干燥样品，涡旋30 s，在冰浴中超声10 mins,使其充分溶解

  9. 在4 ℃，13000 rpm离心15 mins

  10. 将上清液转移至内衬管中，放入LC样品瓶中（若使用RP模式，需要将样品用ddH2O稀释一倍，使得ACN:H2O为1:3以避免溶剂效应），在4 ℃下储存，上机前加入(母液浓度为10 μg/mL的2 μLL-Leucine-d3)进行LC-MS分析

1.2 血浆/血清（极性代谢物提取方案）

  1. 向100 μL血浆/血清中加入2 μL的IS溶液（母液浓度为10 μg/mL的L-Phenyl-d82 μL），涡旋10 s
Tip
  • 一起提取就只加L-Phenyl-d8和DHA-d5
  • 然后分两份，一份测代谢再加L-Leucine-d3。另一份测脂肪酸加混合内标

  1. 添加400 μL MeOH/ACN（v:v, 1:1），涡旋30 s

  2. 在冰水浴中超声10 mins

  3. 在-20 ℃下静置1 h，以促进蛋白质沉淀

  4. 在13000 rpm和4℃下离心15分钟

  5. 取上清液，用真空浓缩器/氮吹仪在4℃下蒸发至干

  6. 将干燥的样品保持在-80℃下长期保存

  7. 在LC-MS分析之前，用100 μL ACN:H2O（v:v，1:1）重新配制干燥的样品

  8. 涡流30 s，在水浴中在4℃下超声处理10 mins

  9. 在13000 rpm和4℃下离心15分钟

  10. 将上清液放入LC样品瓶中，在4℃下储存，上机前加入(母液浓度为10 μg/mL的2 μLL-Leucine-d3)用于LC-MS分析

Note
  • 汇集QC是通过将5-10 μL的每个生物样品汇集并混合到一个QC样品中来制备的。
  • 若为尿液标本，将第2步中的400 μL MeOH/ACN（v:v, 1:1）换成400 μL MeOH即可，其他操作步骤不变。

2 代谢组学液质条件

  1. 检测摸式：正/负离子

  2. 质量范围：80-1200 Da

  3. 液相分析条件

  • 色谱柱：Waters Premier ACQUITY BEH Amide (2.1×100 mm, 1.7 μm)
  • 柱温：25 ℃
  • 流动相：
    • A相:100% H2O+25 mM乙酸铵+25 mM氨水（500 mL体系需加936 μL 25%氨水, PH＜11）
    • B相:100% ACN
  • 洗脱程序：Table 1
Table 1: 洗脱程序
Time[mins] Flow[ml/min] B% Curve
0.000 0.50 95.0 5
0.500 0.50 95.0 5
7.500 0.50 65.0 5
8.000 0.50 40.0 5
9.000 0.50 40.0 5
9.100 0.50 95.0 5
12.000 0.50 95.0 5
  • 进样量：2 μL(按具体情况调整)
  1. 质谱分析条件

  • 源气参数：

    • 离子源：电喷雾离子化源（ESI）

    • Spray Voltage：正离子, 3.0 kV; 负离子, -3.0 kV

    • S-lens RF level：60

    • Capillary temperature：350 ℃

    • Aux gas heater temp：400 ℃

    • 鞘气：50 arb

    • 辅助气：15 arb

    • 反吹气：2 arb

  • 质谱采集参数：请考虑是否需要采集二级。

    • Full MS: Resolution: 70000

    • AGC: 3e6

    • MIT: 100 ms

    • Full MS/dd-MS2: Resolution: 17500

    • AGC: 2e5

    • MIT: 75 ms

    • Top N:6

    • Isolation window:1.0m/z

    • (N)CE:20, 30, 40

    • dd Settings: Minimum AGC: 1.20e3

    • Intensity thresh: 1.6e4

    • Apex trigger: 2 to 4s

    • Dynamic exclus: 8.0s

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