Oxylipins
1 提取
1.1 样品准备
血浆100 μL
组织5-10 mg
细胞（100-300 W）
细胞上清液（参考：100w细胞数，2.4 ml上清液，蛋白量为360 μg）
1.2 血浆/血清
1.向100 μL 血浆中加入400 μL MeOH（预冷，分析级），加入10 μL （d5）DHA标准液(1 μg/ml)，上下颠倒10次。
2.在-20 ℃下静置30min，以促进蛋白质沉淀。4 ℃下，12000 rpm离心20 mins。
3.取上清液，用真空浓缩器/氮吹仪在4 ℃下蒸发至干。干燥样品在-80 ℃下长期储存。
4.在LC-MS分析前，使用100 μL 质谱级MeOH重悬干燥样品，涡旋30 s，在冰浴中超声5 mins, 使其充分溶解。
5.在4 ℃下，12000 rpm离心20 min。将上清液转移至内衬管中，40 μL 上清+2 μL 内标液，进行LC-MS分析。
1.3 细胞
1.细胞计数后，3000 rpm，5 mins，弃掉培养液，0.75% KCl重悬细胞，好离心，弃掉上清液，往沉淀（细胞）中加入400 μL MeOH（预冷，分析级），加入10 μL （d5）DHA标准液(1 μg/ml)，涡旋30 s，超声破碎，10 s 10次，每次中间停止10 s。
2.在-20 ℃下静置30 mins，以促进蛋白质沉淀；4 ℃下，12000 rpm离心20 mins。
3.取上清液，用真空浓缩器/氮吹仪在4 ℃下蒸发至干，干燥样品在-80 ℃下长期储存。
4.在LC-MS分析前，使用100 μL（30-100μL根据样品量定）质谱级MeOH复溶干燥样品，涡旋30 s，在冰浴中超声5 mins, 使其充分溶解。
5.在4 ℃下，12000 rpm离心20 mins；将上清液转移至内衬管中，40μL 上清+2 μL内标液，进行LC-MS分析。
1.4 组织
1.称取5-10 mg组织，加入200 μL H20均质，涡旋30 s，在冰水浴中超声10 mins；4℃，12000 rpm，10 mins，取2 μL上清定蛋白。
2.采用BCA试剂盒定蛋白（若无需定蛋白，直接从第3步开始，即5-10 mg组织加入400 μL甲醇，加入10 μL（d5）DHA标准液(1 μg/ml)）
- 标曲制作：分别吸取蛋白原液（2 mg/ml）0、2、4、6、8、10 μL于96孔板（两个复孔），每个孔加水使其变为10 μL
- 样品稀释：2 μL样品，加入8 μL DD水，稀释5倍
- 配制AB工作液：按A:B=50:1的比例配制工作液，每个孔中分别加入200 μL工作液
- 摇匀10 mins，酶标仪570 mm测定吸光度，将样品吸光度代入标曲进行计算
3.加入800 μL MeOH（预冷，分析级），加入10 μL（d5）DHA标准液(1 μg/ml)，重悬30 s，在冰水浴中超声10 mins；在4 ℃下，12000 rpm离心15 mins（若组织不易沉淀，如肺组织，脑组织，请多次转移上清及离心至没有明显沉淀）。
4.取上清液，用真空浓缩器/氮吹仪在4 ℃下蒸发至干；干燥样品在 -80 ℃下长期储存。
5.在LC-MS分析前，使用100 μL（30-100μL根据样品量定） 质谱级MeOH复溶干燥样品，涡旋30 s，在冰浴中超声5 mins, 使其充分溶解；在4 ℃下，12000 rpm离心20 mins(如果有较多沉淀，进行二次离心至无明显沉淀),将上清液转移至内衬管中，40 μL上清+2 μL内标液，进行LC-MS分析。
1.5 SPE柱法（推荐)
1 mL甲醇活化柱子，1 mL水平衡柱子，过上清液，10%甲醇水1 mL除杂，1 mL甲醇洗脱，氮吹吹干，50 μL甲醇复溶。
2 测样
1. 固定体积上样：取40 μL样品，加入2ul内标（内标母液：500 ng/mL）,1)（如果取30 μL，标曲相应制成30 μL+2 μL体系）
2. 标曲：制0.7825 ng/ml、1.5625 ng/ml、3.125 ng/ml、6.25 ng/ml、12.5 ng/ml、25 ng/ml 、50 ng/ml、100 ng/ml、的8个标准品浓度，取40 μL标准品溶液加入2 μL内标（内标母液：500 ng/ml）。
3. 测样顺序
第一针进标准品混标（10 ng/ml,进2 μL），确定化合物出峰均在窗口内，RT飘动幅度大的物质需要对RT进行更改。
第二针进标准品混标，确定化合物均在窗口内出峰。
第三针进QC样品，确定样品的丰度与响应。
第4针开始进样品，各组间平行进样品（如：control组进三针，模型组进三针，阳性药组进三针），10针样品间进一针QC（根据总样品束确定进QC的针数）
4.内标检测
对已经完成检测的样品，使用OS软件进行内标峰面积监测，先对各峰积分情况进行查看，将数据导出至excel表格，计算“化合物/相应内标”RSD值小于10%，对于峰面积异常的样品进第二针，若峰面积依旧异常，属于内标没有加准，需重新制样。对（d5）DHA 峰面积进行RSD值计算，偏差较大的样品判定为提取误差较大的样品，统计时需排除。
3 非靶向氧化脂肪酸液质条件
检测摸式：负离子
质量范围：200-800 Da
液相分析条件
- 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSST3 (2.1×100 mm，1.7 μm）
- 柱温：40 ℃
- 流动相：
- A相:30%乙腈水+0.1%甲酸
- B相:50%乙腈+50%异丙醇+0.02%甲酸
- 洗脱程序：Table 1
| Time[mins] | Flow[ml/min] | B% | Curve |
|---|---|---|---|
| 0.000 | 0.25 | 25.0 | 5 |
| 0.250 | 0.25 | 25.0 | 5 |
| 1.500 | 0.25 | 55.0 | 5 |
| 3.000 | 0.25 | 65.0 | 5 |
| 5.500 | 0.25 | 99.0 | 5 |
| 9.000 | 0.25 | 99.0 | 5 |
| 9.500 | 0.25 | 25.0 | 5 |
| 15.000 | 0.25 | 25.0 | 5 |
- 进样量：2 μL
>5 μL需申请
- 质谱分析条件
源气参数：
离子源：电喷雾离子化源（ESI）
Spray Voltage：负离子, -2.8 kV
S-lens RF level：65
Capillary temperature：350 ℃
Aux gas heater temp：320 ℃
鞘气：30 arb
辅助气：15 arb
反吹气：0 arb
质谱采集参数：请考虑是否需要采集二级。
采集模式：T-SIM
Full MS: Resolution: 17500
AGC: 2e5
MIT: 35 ms
3.1 靶向氧化脂肪酸液质条件
开发中。。。。